Fluorescence microscopy

ABSTRACT

Although fluorescence microscopy permeates all of cell and molecular biology, most biologists have little experience with the underlying photophysical phenomena .Understanding the principles underlying  fluorescence microscopy is useful when attempting to solve imaging problems. Additionally, fluorescence microscopy is in a state of rapid evolution, with new techniques, probes and equipment appearing almost  daily. Familiarity with fluorescence is a prerequisite for taking advantage of many of these developments. This review attempts to provide a framework for understanding excitation of and emission by fluorophores, the way fluorescence microscopes work, and some of the ways fluorescence can be optimized .

INTRODUCTION

  Many of the technical improvements in microscopes over the years have centered on increasing the contrast between what is interesting (signal) and what is not (background). Fluorescence microscopy is the  quintessential example, as it aims to reveal only the objects of interest in an otherwise black background. Because of its intrinsic selectivity, fluorescence imaging has become the mainstay of microscopy in the service of biology. Over the past several decades, organic chemists have devised many thousands of fluorescent probes that provide a means of labeling virtually any imaginable aspect of biological systems. For example, the Molecular Probes Handbook, tenth edition online (http://probes.invitrogen.com/handbook/), which is perhaps the largest compendia of fluorescence applications for biologists, has 23 chapters, 14 of  which describe the 3,000 or so fluorescent probes for a wide range of cell biological questions. The large spectral range of available fluorophores allows simultaneous imaging of different cellular, subcellular or molecular components .In addition, the co-opting of intrinsically fluorescent gene products, most notably green fluorescent protein (GFP) and its variants, has allowed molecular biologists to genetically tag protein components of living systems and usher in a new era for fluorescence. Lastly, the rapidly advancing innovations of laser scanning confocal and two-photon microscopes mean that fluorescence  approaches now provide a powerful approach to seeing microscopic structures in three dimensions, even deep within tissues. For these reasons it is difficult to do cell or molecular biology without understanding the basics of fluorescence, and this trend is accelerating. According to PubMed, 127,804 articles used the word ‘fluorescence’ in their title or abstract in 2004—that is more than the total number of fluorescence papers in the previous five years (1999-2003) combined. Our aim is to describe concepts that underpin fluorescence microscopy and highlight some of the pitfalls frequently encountered.

چکیده

اگر چه میکروسکوپ فلورسنس نفوذ تمام زیست شناسی سلولی و مولکولی است، اکثر زیست شناسان تجربه کمی در زمینه پدیده های فوتوفیزیکی پایه دارند. شناخت اصول زیر میکروسکوپ فلورسانس مفید است هنگام تلاش برای حل مشکلات تصویربرداری. علاوه بر این، میکروسکوپ فلورسانس در حالت تکامل سریع است، با تکنیک های جدید، پروب ها و تجهیزات تقریبا روزانه ظاهر می شود. آشنایی با فلورسانس یک شرط لازم برای استفاده از بسیاری از این پیشرفتهاست. این بررسی تلاش می کند چارچوبی برای درک تحریک و انتشار توسط فلوروفورها، نحوه کارکرد میکروسکوپ های فلورسانس و برخی از روش های فلورسنس را بهینه سازی کند.

مقدمه

بسیاری از پیشرفت های فنی در میکروسکوپ ها در طول سال ها بر افزایش کنتراست بین آنچه جالب است (سیگنال) و آنچه که (پس زمینه) نیست. میکروسکوپ فلورسانس نمونهی دلخواه است، زیرا هدف آن فقط آشکارسازی اشیاء مورد علاقه در پس زمینه سیاه و سفید است. به علت انتخابی ذاتی آن، تصویربرداری فلورسنت به عنوان اصلیترین میکروسکوپ در خدمت زیست شناسی تبدیل شده است. در طول چند دهه گذشته، شیمیدان های آلی هزاران پروب فلورسنت را طراحی کرده اند که ابزاری برای برچسب زدن تقریبا هر جنبه ای قابل تصور از سیستم های بیولوژیکی است. برای به عنوان مثال، کتابچه راهنمای مولکول Probes، نسخه دهم ویرایش آنلاین (http://probes.invitrogen.com/handbook/)، که شاید بزرگترین مجموعه کاربرد برنامه فلورسانس برای زیست شناسان است، 23 فصل دارد، که 14 مورد آن 3000 یا فلورسنت پروب برای طیف گسترده ای از سوالات بیولوژیک سلولی. محدوده طیف وسیعی از فلوروفورهای موجود امکان تصویربرداری همزمان مولکولهای مختلف سلولی، سلولی یا مولکولی را فراهم می آورد. علاوه بر این، همکاری محصولات ژن های فلورسنت درونی، به ویژه پروتئین فلورسنت سبز (GFP) و انواع آن، به ژنتیک زیست شناسان مولکولی اجازه داده است تركيبات پروتئيني سيستم هاي زنده را تكميل كنيد و در عصر جديدي براي فلورسانس استفاده كنيد. در نهایت، نوآوری های به سرعت در حال پیشرفت از تکنیک های لیزر پانکولک و میکروسکوپ دو فوتون به این معنی است که رویکردهای فلورسانس اکنون یک رویکرد قدرتمند برای دیدن ساختارهای میکروسکوپی در سه بعد، حتی عمیق در بافت ها است. به همین دلیل دشوار است که زیست شناسی سلولی یا مولکولی را بدون درک اصول فلورسنس، و این روند تسریع شود. طبق نظر PubMed، 127804 مقاله در سال 2004 از کلمه “فلورسانس” در عنوان یا انتزاعی استفاده کردند که بیشتر از تعداد کل مقالات فلورسانس در پنج سال گذشته (1999-2003) است. هدف ما توصیف مفاهیم است که بر پایه میکروسکوپ فلورسانس تأکید دارند و برخی از مشکلات را که اغلب با آن روبرو هستند مواجه می شوند.

Year: 2005

Publisher : ELSEVIER

By :  Jeff W Lichtman & José-Angel Conchello

File Information: English Language/ 10 Page / size: 413 KB

Download

سال : 1394

ناشر : ELSEVIER

کاری از : جف W Lichtman و خوزه فرشته Conchello

اطلاعات فایل : زبان انگلیسی / 10 صفحه / حجم : KB 413

لینک دانلود