Newly developed primers for the detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis

توضیحات

ABSTRACT

Recent publications reported the existence of IS900 like sequences in mycobacteria different from  Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map). The primers used for IS900 detection of Map have amplified these sequences causing false positive results. In this study, we have developed two new PCR  assays for the detection of Map. The first assay is based on the IS900 sequence using primers different from the ones previously reported, the second assay on the f57 sequence. The specificity of the tests was  checked by analysis of 190 mycobacterial isolates (74 Map and 116 non-Map isolates). All Map strains were positive and all non-Map strains were negative. Serial dilutions of Map bacteria were used to assess the  sensitivity of the assays. We achieved a sensitivity of 1 CFU per PCR for both assays. In addition, a PCR- simulating computer programme was used to evaluate the specificity of the new IS900 primers. The combination of the two PCR assays has proven to be useful for the identification of Map but validation on a large range of clinical samples still needs to be done.

INTRODUCTION

Paratuberculosis or Johne’s disease is a chronic and incurable disease of domestic and wild animals (in  particular ruminants) caused by infection with Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map). The  disease is characterised by chronic diarrhoea and the symptoms of a general infectious process. Emaciation,
decreased milk production, oedema, anaemia, infertility and eventually death are the dominant signs during the late stage of the disease. Large numbers of Map organisms may be shed in the faeces, thereby  contaminating the environment (Cocito et al., 1994; Harris and Barletta, 2001). The application of molecular methods for the diagnosis of paratuberculosis is under constant de-  velopment and evaluation. A number of genes and sequences unique to Map have been identified over the years. The IS900 sequence was  discovered in the late 1980s (Stevenson and Sharp, 1997). This insertion sequence is a 1451 bp segment that lacks inverted terminal repeats and is repeated 15–20 times in the Map genome (Green et al., 1989). The f57 sequence was shown to be specific for the Johne’s disease agent and is not found in any other  mycobacterial species or M. avium subspecies avium. It is a 620 bp segment with a G + C content of 58.9% (Coetsier et al., 2000; Harris and Barletta, 2001).

چکیده

انتشارات اخیر نشان داد که IS900 مانند توالی هایی در میکوباکترها متفاوت از Paratuberculosis گونه های Mycobacterium avium است. آغازگرهای مورد استفاده برای شناسایی IS900 نقشه، این توالی ها را افزایش داده و نتایج مثبت کاذب ایجاد می کند. در این مطالعه، دو آزمایش جدید PCR برای تشخیص نقشه ایجاد شده است. اولین تست براساس توالی IS900 با استفاده از primers متفاوت از موارد قبلا گزارش شده است، تست دوم در توالی f57. ويژگي آزمايش ها با تجزيه و تحليل 190 جدايه ميکوباکتري (74 نقشه و 116 جدايه بدون نقشه) مورد ارزيابي قرار گرفت. تمام سويه هاي نقشه مثبت بودند و تمام سويه هاي بدون نقشه منفي بودند. برای ارزیابی حساسیت آزمایشات، رقت های سریال از باکتری های نقشه استفاده شد. برای هر دو آزمایش، حساسیت 1 CFU در هر PCR به دست آمد. علاوه بر این، یک برنامه کامپیوتری شبیه سازی PCR برای ارزیابی خاصیت آغازین جدید IS900 مورد استفاده قرار گرفت. ترکیبی از دو آزمایش PCR ثابت شده است که برای شناسایی نقشه مفید است، اما اعتبار سنجی در طیف وسیعی از نمونه های بالینی هنوز باید انجام شود.

مقدمه

Paratuberculosis یا بیماری یونس یک بیماری مزمن و غیر قابل درمان حیوانات خانگی و وحشی (به ویژه مجاری گوسفند) ناشی از عفونت با پاراتوبرکلوز زیره Mycobacterium avium است. بیماری با اسهال مزمن و علائم یک بیماری عفونی عمومی مشخص می شود. ناباروری کاهش تولید شیر، ادم، کم خونی، ناباروری و در نهایت مرگ علائم غالب در اوایل مرحله بیماری است. تعداد زیادی از موجودات نقشه ممکن است در دفع فاضلاب ریخته شوند، در نتیجه محیط آلوده می شوند (Cocito et al.، 1994؛ Harris and Barletta، 2001). استفاده از روش های مولکولی برای تشخیص پاراتوبرکلوزیس در حال توسعه و ارزیابی است. تعدادی از ژن ها و توالی های منحصر به فرد نقشه ها در طول سال ها شناسایی شده اند. توالی IS900 در اواخر دهه 1980 کشف شد (Stevenson and Sharp، 1997). این دنباله درج یک بخش 1451 بیتی است که تکرارهای ترمینال معکوس ندارد و 15-20 بار در ژنوم نقشه تکرار می شود (Green et al.، 1989). توالی F57 مشخصه ای برای عامل بیماری Johne است و در هیچ گونه گونه های میکوكتراكی یا گونه Avium مكانیك Avium وجود ندارد. این یک بخش 620 بیتی با محتوای G + C 58.9٪ است (Coetsier et al.، 2000؛ Harris and Barletta، 2001).

Year: 2004

Publisher : ELSEVIER

By : Elke Vansnick , Pim de Rijk , Francis Vercammen ,Dirk Geysen , Leen Rigouts , Françoise Portaels

File Information: English Language/ 8 Page / size: 69.14 KB

Only site members can download free of charge after registering and adding to the cart

Download tutorial

سال : 1383

ناشر : ELSEVIER

کاری از : الك ونسنيك، پيم د ريك، فرانسيس وكراممن، ديرك گيزن، لن ريگوتس، فرانسوا پورتال

اطلاعات فایل : زبان انگلیسی / 8 صفحه / حجم : KB 69.14

فقط اعضای سایت پس از ثبت نام و اضافه کردن به سبد خرید می توانند دانلود رایگان کنند.خوشحال می شویم به ما پبیوندید

آموزش دانلود